http://www.bioon.com/bioindustry/foods/342879.shtml

來源 上?？平膛d農(nóng)網(wǎng) 2007-11-6

轉(zhuǎn)基因蔬菜研究的進(jìn)展
 

2009年，國內(nèi)生物醫(yī)藥的突破之年。不僅有干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的新突破，還有轉(zhuǎn)基因作物政策的新舉措。

摘要：利用DNA重組技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)入蔬菜中，培育成的蔬菜稱為轉(zhuǎn)基因蔬菜。它主要是用來選育具有特殊性狀的蔬菜新品種。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)人們能最大限度地利用感興趣的外源基因。使蔬菜育種工作具有更強(qiáng)的針對性。本文綜述了轉(zhuǎn)基因蔬菜在抗病毒、抗蟲、抗除草劑、延遲成熟及品質(zhì)改良等方面的進(jìn)展和現(xiàn)狀，展示了基因轉(zhuǎn)化技術(shù)在蔬菜品種改良上廣闊的應(yīng)用前景。

　關(guān)鍵詞：蔬菜：轉(zhuǎn)基因

　生物技術(shù)為培育高產(chǎn)、高抗、多抗、優(yōu)良的新品種提供了科學(xué)的手段，特別是轉(zhuǎn)基因蔬菜的研究，為蔬菜育種、病蟲害防治及品種改良做出了巨大貢獻(xiàn)。蔬菜轉(zhuǎn)基因育種就是將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于蔬菜改良。蔬菜基因工程是在重組DNA技術(shù)上發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，綜合了分子生物學(xué)、微生物學(xué)和植物組織培養(yǎng)等現(xiàn)代技術(shù)和方法，將外源目的基因經(jīng)過或不經(jīng)過修改，通過生物、物理或化學(xué)的方法導(dǎo)人蔬菜，以改良其性狀，得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲及抗逆性強(qiáng)的蔬菜新品種。

　世界上第一個商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物品種就是轉(zhuǎn)基因蔬菜，也就是1994年美國Calgene公司推出的轉(zhuǎn)基因耐貯番茄品種FlawSaw，它是通過分離一個與乙烯代謝有關(guān)的氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)合成酶基因然后再將其反向(反義)導(dǎo)人番茄。從而抑制乙烯的合成，其果實長期保持綠色硬實，易于運輸和貯藏。

   由于在一些蔬菜作物上建立了比較成熟的再生和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，因而蔬菜作物的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展較快。到目前為止，已進(jìn)行轉(zhuǎn)基因并獲得轉(zhuǎn)基因植株的蔬菜有番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、菠菜、生菜、甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、油菜、黃瓜、西葫蘆、豇豆、豌豆、茄子、辣椒、洋蔥、石刁柏、芥菜等。所改良的農(nóng)藝性狀包括抗病、抗蟲、抗除草劑、延熟保鮮及其它品質(zhì)的改良等。所采用的轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法和DNA直接轉(zhuǎn)移法，后者又包括PEG法、電擊法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、脂質(zhì)體法等。

　1. 抗病毒基因的轉(zhuǎn)化

　植物病害主要分為細(xì)菌病害、真菌病害和病毒病三類。病毒病一直是蔬菜生產(chǎn)最主要的病害之一，采用常規(guī)育種方法結(jié)合使用殺菌劑雖然取得了一定的成效，仍不能徹底解決病害問題且常規(guī)育種方法周期長，抗性資源有限，另外，大量使用殺菌劑除對蔬菜品質(zhì)影響外，對環(huán)境也造成污染。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益完善，為培育抗病品種，有效改良蔬菜提供了一條全新的途經(jīng)。通過克隆與抗病有關(guān)的基因?qū)胫参矬w內(nèi)，提高作物的抗病性。

  目前，已獲得許多抗病的工程植物。利用最多的一種方法是通過遺傳轉(zhuǎn)化將病毒外殼蛋白(CoatProtein，CP)編碼基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞表達(dá)，這些病毒外殼蛋白在植物細(xì)胞中的積累，能夠抑制侵染病毒的復(fù)制，從而減輕癥狀或推遲病毒發(fā)生的時間。Powell等利用此方法首次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄獲得了大量抗病毒番茄植株。這一方法被迅速應(yīng)用于其它病毒和植物，至今已克隆了至少15個病毒組的3O種病毒的cp基因，并成功地轉(zhuǎn)化了20多種植物，轉(zhuǎn)基因植物對相應(yīng)病毒均表現(xiàn)出不同程度的抗性。

   此外，病毒復(fù)制酶基因、病毒的反義RNA基因、病毒的衛(wèi)星RNA及一些非病毒來源的基因，目前均有很大發(fā)展。宋艷如等構(gòu)建了PVX+PVY+PLRV(卷葉病毒)雙價外殼蛋白基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

  1992年我國成功克隆黃瓜花葉病毒蛋白基因，建立良好的載體系統(tǒng)，并將其轉(zhuǎn)入番茄品種內(nèi)，首次獲得抗黃瓜花葉病毒轉(zhuǎn)基因番茄新植株。李華平等將黃瓜花葉病毒衣殼蛋白基因轉(zhuǎn)入辣椒，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。王慧中等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源的西瓜花葉病毒2號(WMV-2)CP基因?qū)朦S瓜，轉(zhuǎn)基因的黃瓜已開花結(jié)果并獲得子一代植株。轉(zhuǎn)基因子一代植株對WMV-2表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。

   畢玉平等構(gòu)建了TMVcp和CMVcp雙價植物載體，轉(zhuǎn)化番茄，獲得再生植株。通過點雜交、PCR檢測和Southern雜交證實為轉(zhuǎn)基因植株，且比對照植株表現(xiàn)出明顯的抗性。郭亞華等利用發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的二元載體，將TMV．cp和CMV-cp基因?qū)胩鸾分?，?jīng)PCR、ELISA檢測證明這兩個基因?qū)胩鸾分仓瓴⒁驯磉_(dá)。

   盧愛蘭等以子葉柄為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將表達(dá)載體中蕪菁花葉病毒基因?qū)敫仕{(lán)型油菜，并獲得具有不同程度抗性的植株?，F(xiàn)在人們利用外殼蛋白基因已獲得的抗病毒蔬菜有：抗ALMV番茄、抗PVS馬鈴薯、抗CMV辣椒、黃瓜、馬鈴薯、番茄、甜瓜、抗WMVSMV大豆、甜瓜、馬鈴薯、番茄等。

　此外，能分解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)酶、β-1，3葡聚糖酶基因、病程相關(guān)蛋白基因、溶菌酶基因的分離、克隆、表達(dá)的研究，將為蔬菜抗細(xì)菌和真菌病基因工程及抗病育種提供更多的選擇。

　2. 抗蟲基因的轉(zhuǎn)化

　蟲害是蔬菜生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題用常規(guī)的育種方法很難育成較好的抗蟲品種。植物抗蟲基因工程的誕生，為防治害蟲提供了一條嶄新的途徑。目前應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因主要有兩種，即來源于蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白(簡稱Bt．toxin)基因和來源于植物的蛋白酶抑制劑因子(p1)基因。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因產(chǎn)物對鱗翅目昆蟲有很強(qiáng)的毒殺效力，是目前世界上應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因。

    蛋白酶抑制劑是一類存在于某些植物中的蛋白質(zhì)，它能抑制昆蟲或動物消化系統(tǒng)的蛋白酶活性，對植物起著天然保護(hù)作用。豇豆的胰蛋白酶抑制劑(簡稱CpTI)被認(rèn)為是最有效的蛋白酶抑制劑。它具有廣譜抗蟲性，對鱗翅目、鞘翅目及直翅目的許多昆蟲都有毒殺活性。目前已轉(zhuǎn)基因抗蟲蔬菜有番茄、馬鈴薯、青花菜、花椰菜、小白菜、油菜等。

  1987年，F(xiàn)ischhoff等首次獲得了轉(zhuǎn)Bt基因的番茄。Iannacone等將Btcry3基因進(jìn)行改造，去除了影響表達(dá)不穩(wěn)定元件，選用了植物偏愛的密碼子，極大地提高了毒蛋白的表達(dá)水平，獲得了高抗鞘翅目甲蟲的茄子。李學(xué)寶等。通過油菜子葉外植體一農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法將蘇云金桿菌殺蟲蛋白基因?qū)敫仕{(lán)型油菜，獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因植株。部分轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的殺蟲活力，用轉(zhuǎn)基因植株葉片飼喂甜菜夜蛾幼蟲后，幼蟲出現(xiàn)中毒癥狀，導(dǎo)致幼蟲發(fā)育受阻和死亡。

   方宏筠等¨將豇豆胰蛋白酶(cp．TI)基因?qū)敫仕{(lán)栽培品種“京豐”和“迎春”，獲得抗菜青蟲的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)。張七仙等將CpTI基因?qū)敫仕{(lán)，轉(zhuǎn)基因植株對小菜蛾具有明顯抗性且外源基因轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％。梁小友等以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄，將CMV—cp基因和Bt—toxin基因同時導(dǎo)入轉(zhuǎn)化再生的番茄植株。RNA點雜交證明CMV．cp基因和Bt—toxin基因已在轉(zhuǎn)基因番茄植株中同時獲得表達(dá)。

　3. 抗除草劑基因的轉(zhuǎn)化

　在進(jìn)行除草劑抗性的基因工程時，有兩條途徑可供選擇：一是修飾除草劑作用的靶蛋白(herbicidetargetprotein)，使其對除草劑不敏感，或促其過量表達(dá)以使植物吸收除草劑后仍能進(jìn)行正常代謝；二是導(dǎo)入外源基因使除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒。目前來源于潮濕鏈霉菌的bar基因應(yīng)用較多，此基因編碼的蛋白可將除草劑PPT乙?；?，使其失去毒力，bar基因已被轉(zhuǎn)入番茄和油菜等作物中。美國已大面積推廣應(yīng)用耐除草劑的大豆品種。彭仁旺等以油菜子葉柄為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)Northernblot等檢測，barstar基因及bar基因在轉(zhuǎn)基因植物中得到正確的調(diào)控與表達(dá)。

　4. 抗逆基因的轉(zhuǎn)化

　抗逆基因工程的研究主要集中在逆境條件下才能表達(dá)的某些基因的研究以及抗逆代謝過程中某些酶的研究?，F(xiàn)在已分離出大量與抗逆代謝相關(guān)的基因。如與抗凍有關(guān)的鰈魚的抗凍蛋白(AFPs)、抗凍糖蛋白(AFGPs)及昆蟲的溫衡蛋白。與抗旱有關(guān)的基因，如肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Imil)、繭蜜糖合成酶基因等。與抗鹽有關(guān)的基因，如脯氨酸合成酶(proA)、山菠菜堿脫氫酶(BADH)、磷酸甘露脫氫酶(milD)基因等。

   李銀心等¨糾將山菠菜堿醛脫氫酶(BADH)基因經(jīng)根癌土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入豆瓣菜，轉(zhuǎn)基因植株能夠在0．5％Nacl培養(yǎng)基上正常生長，而對照在相同的培養(yǎng)基上生根困難且生長緩慢。美國的Hightower等將鰈魚科的抗凍基因轉(zhuǎn)入番茄和煙草中，發(fā)現(xiàn)具有抑制冰塊重新結(jié)冰的能力，這一結(jié)果給冰凍保鮮蔬菜展示了誘人前景。

　5. 延遲成熟及其它品質(zhì)改良

　乙烯控制著植物的許多生理和發(fā)育過程，如果實成熟、脫落、和衰老等通過克隆對乙烯生物合成過程中的ACC合成酶基因并轉(zhuǎn)入植物來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的乙烯合成，從而影響乙烯參與的多種生理過程。如控制果實的成熟時間，達(dá)到延遲成熟，延長保鮮期，提高耐貯藏性。湯富強(qiáng)等Ⅲ進(jìn)行了ACC合成酶基因及其反義基因轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得及其部分生理特性的研究。

    王春霞等以西瓜無菌苗子葉為外植體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行葉盤共培養(yǎng)，將NptlI基因和番茄的ACC合成酶基因及其反義基因轉(zhuǎn)入西瓜。Southernblot結(jié)果證明獲得轉(zhuǎn)基因植株，乙烯釋放指標(biāo)表明轉(zhuǎn)入的正義和反義ACC合成酶基因得到不同程度的表達(dá)。ACC解氨酶可通過抑制乙烯的產(chǎn)生，來達(dá)到延緩衰老，保持新鮮的目的。李賢等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，以下胚軸為外植體把ACC解氨酶基因轉(zhuǎn)入青花菜栽培品種獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。

　目前，蔬菜品質(zhì)改良是蔬菜育種的主要目標(biāo)之一。將一些有價值的外源基因?qū)胧卟?，對改良蔬菜品質(zhì)也是大有作為的。將種子特異性啟動子控制的硬脂酸去飽和酶反義基因?qū)胗筒耍钥刂瓢l(fā)育階段的油菜籽硬脂酸乙酰載體蛋白去飽和酶活性使轉(zhuǎn)基因油菜籽硬脂酸的含量上升幾十倍。

    Stark等獲得一種同源四聚體AGPase基因，該基因連接質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽基因和馬鈴薯塊莖特異表達(dá)的啟動子后轉(zhuǎn)化馬鈴薯，得到的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯淀粉較對照增加35％，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例確定食品的加工品質(zhì)，基因工程可以改變這種比例。王光清等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤共培養(yǎng)法將npt基因和玉米醇溶蛋白基因(zein)與HEAAE融合基因?qū)笋R鈴薯品種“東農(nóng)303”，證明整合與表達(dá)。李雷等將玉米

　1Oku醇溶蛋白基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中得到表達(dá)。氣生塊莖和大田塊莖的氨基酸分析表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中含硫氨基酸含量有明顯提高。呂德?lián)P等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也將含硫氨基酸蛋白基因轉(zhuǎn)入苜蓿，成功地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株再生。劉敬梅等刮以萵苣子葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，成功地進(jìn)行了馬檳榔甜蛋白基因MBLII對萵苣的遺傳轉(zhuǎn)化。鄭回勇等將人乳鐵蛋白基因插入pBIN121質(zhì)粒Xba、Sac之間，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入胡蘿1-受體，經(jīng)PCR檢測，初步確定抗性植株為轉(zhuǎn)入乳鐵蛋白基因植株。

　6. 展望

　基因工程方法改良蔬菜品種成果顯著，并在蔬菜遺傳育種，品種改良上的前景十分誘人。但存在轉(zhuǎn)化成功作物品種少，轉(zhuǎn)化率不高，結(jié)果不穩(wěn)定等問題。今后研究的重點應(yīng)放在開發(fā)較多的有重要價值的目的基因，完善轉(zhuǎn)化技術(shù)，以達(dá)到蔬菜改良的目的。

　作者：陶雷吳瑩東北林業(yè)大學(xué)

　袁紅梅大慶師范學(xué)院

　趙麗娟黑龍江省農(nóng)科院作物育種所

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